ELISA Kitleri Test Gereksinimleri

Resmi testte iyi bir kontrast yapılmalı, pozitif ve negatif kontrolün test koşulları alınmalı ve test sonuçlarının doğruluğunu sağlamak için test edilecek numuneler iki kopya halinde yapılmalıdır.

Bazen arka plan daha yüksek olup spesifik olmayan bir reaksiyonu gösterir ve koyun serumu, tavşan serumu veya BSA ile kapatılabilir.

Deney koşullarının seçimi

ELISA'da aşağıdakiler de dahil olmak üzere çeşitli deneysel koşulların seçilmesi önemlidir: (1) Katı-faz taşıyıcılarının seçimi: PVC, polistiren, poliakrilamid ve selüloz gibi birçok madde katı-faz taşıyıcıları olarak kullanılabilir. İçbükey plaka, test tüpü, boncuk vb. şeklini alabilir. Şu anda yaygın olarak 40 kuyulu polistiren içbükey plakalara sahip olmak için kullanılır.

Ne tür bir taşıyıcı olursa olsun, kullanımdan önce taranabilir: aynı miktarda antijen paketi ile, aynı deneysel koşullar altında reaksiyona girecek, renksel geriverim reaksiyonunun homojen olup olmadığını gözlemleyecek, buna göre iyi bir adsorpsiyon performansı olacaktır. (2) Antikor (veya antijen) seçimine göre paketleme: katı -faz taşıyıcının yüzeyine adsorbe edilen antikor (veya antijen), gereksinim şiddeti daha iyidir, adsorpsiyon genellikle 9,0 ila 9,6 arasında PH gerektirir. Adsorpsiyon sıcaklığı, süresi ve protein miktarının da belirli bir etkisi vardır; genellikle 4 derece C'nin üzerinde 18 ila 24 saat. Protein paketlerinin optimum konsantrasyonunun titre edilmesi gerekir: farklı protein konsantrasyonlarıyla (0,1, 1,0 ve 10 µg/ml vb.) paketlendikten sonra, diğer test koşulları aynı olduğunda pozitif numunelerin OD değerleri gözlemlenir. En büyük OD değerine ve en düşük protein miktarına sahip konsantrasyonu seçin.

Çoğu protein için bu genellikle 1 ila 10 µg/ml'dir. (3) Enzim-etiketli antikor çalışma konsantrasyonunun seçimi: ilk olarak, doğrudan ELISA yöntemini kullanarak titrasyonun başlangıç ​​etkisi (enzim-etiketli antikor kısmına bakın).

Daha sonra diğer koşulları düzeltin veya resmi deney sistemindeki "kare dizi yöntemini" (paket keskinliği, incelenecek numune için referans ve enzim-etiketli antikorlar farklı seyreltmelerdir) kullanın ve çalışma konsantrasyonunu doğru bir şekilde titre edin. (4) Enzim bazının ve hidrojen donörünün seçimi: Hidrojen donörünün seçimi ucuzdur, güvenlidir, berrak bir renk-verim reaksiyonuna sahiptir ve kendisi de renksizdir. Bazı hidrojen vericilerin (örn. OPD vb.) kanserojen etkileri vardır, korunmaya dikkat edilmelidir. Şartlı kişiler, -karsinojenik olmayan, yüksek hassasiyete sahip hidrojen donörlerini kullanmalıdır; örneğin TMB ve ABTS şu anda daha tatmin edici hidrojen donörleridir. Bir etki süresinden sonra reaksiyonu durdurmak için güçlü asitler veya alkaliler eklenmelidir. Genellikle substratın etki süresi 10-30 dakika kadardır. Substrat kullanım sıvısı, özellikle kullanımdan önce H2O2 eklenmişse taze olarak hazırlanmalıdır.